实时RT
前言
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是导致猪群严重腹泻和脱水的主要病因。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科,是一种有包膜,单股正链RNA病毒,基因组大小约28KB。1971年英国首次报道发现猪流行性腹泻病毒,而日本,中国,韩国和泰国同样报道过猪流行性腹泻病毒感染。美国在2013年5月(1-5)第一次检测到猪流行性腹泻病毒。兽医诊断实验室快速研发敏感及特异性的实时RT-PCR(RRT-PCR)方法,以检测在各种猪和环境样品中的PEDV。在这项研究中,我们将明尼苏达州(UMN)大学研究的猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎多重RRT-PCR检测方法与商品化猪传染性胃肠炎病毒-猪流行性腹泻病毒多重RRT-PCR检测方法进行了对比。
材料和方法
猪小肠标本,粪便样品,粪拭子,唾液样品,环境样品被定期提交给美国明尼苏达大学(UMN)兽医诊断实验室进行肠道病原体检测。样品匀浆后利用MagMAX96病毒RNA提取试剂盒(赛默飞科技)提取RNA,根据试剂盒说明书进行操作。商品化猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻病毒多重RRT-PCR方法已经初步成形,根据试剂盒说明书进行操作,而UMRRT-PCR检测方法是利用Path-ID多元一步法RT-PCR试剂盒(赛默飞科技),根据试剂盒说明书进行操作。
结果
猪唾液样品(N=39),肠匀浆标本(N=107),粪便样品(N=136),粪拭子(N=47),呕吐样品(N=12)和环境样品(n=55),共计396份样品,用来对比UMNTGEV-PEDV多重RRT-PCR法和商品化TGEV-PEDV多重RT-PCR法。该UMNTGEV-PEDV多重RRT-PCR比商品化TGEV-PEDV多重RT-PCR有较低的Ct值。该UMNTGEV-PEDV多重RRT-PCR法比商品化TGEV-PEDV多重RT-PCR多检测到53份阳性PEDV样品(其中唾液样品6份,肠匀浆样品9份,粪便样品6份,粪拭子样品13份和环境样品19份)。这些商品化TGEV-PEDV多重RT-PCR检测为阴性而UMNTGEV-PEDV多重RRT-PCR法另外检测到的PEDV阳性标本,由二重UMNPEDVRRT-PCR,针对N基因扩增,确认为阳性。该UMNTGEV-PEDV多重RRT-PCR法比商品化TGEV-PEDV多重RT-PCR多检测到11份TGEV阳性样品(其中肠样品4份,粪便样品7份)。
结论与讨论
UMNTGEV-PEDVRRT-PCR法比商品化TGEV-PEDV多重RT-PCR法具有更多优势。精确的检测PEDV和TGEV临床样本对于最大限度地减少这两种病毒的传播是很重要的。临床诊断实验室就是提供高灵敏度和特异性测定法,以帮助防止和控制病原体,所以许多检测方法必须经过评估,然后筛选出养猪行业的最佳检测方法。
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