实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。

实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

实验器材

1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌或者枯草杆菌，培养24小时的大肠杆菌

2、染色液和试剂：结晶紫、3）、卢哥氏碘液、4）、95%酒精、蕃红、5）、复红、2）、二甲苯、香柏油

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

实验方法：

1、简单染色：

涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。

晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定

染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。

水洗：用水洗去涂片上的染色液

干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

2、革兰氏染色：

涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。

晾干：与简单染色法相同。

固定，与简单染色法相同

结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1分钟。

水洗：清去染色液，用水小心地冲洗。

媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。

水洗：用水洗去碘液。

脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。

复染：滴加蕃红复染5min。

水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。

晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。

镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。

②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。

实验作业

给出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。

注意事项

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

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