摘要：为比较不同核酸提取试剂盒对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸的提取效率，使用国家标准物质“猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质”作为模拟样品，分别使用试剂盒A、B、C（磁珠法）以及试剂盒D、E（柱式法）等5种核酸提取试剂盒进行核酸提取，然后通过荧光RT-PCR和数字RT-PCR方法评估提取效率，并分析不同基质对提取效率的影响。结果显示：5种试剂盒均能有效提取PRRSV RNA，其中磁珠法的提取效率高于柱式法；试剂盒B和C对PRRSV RNA的提取效率较高；基质会对提取效率造成影响，精液和抗凝血对试剂盒提取效率的影响较大。综上，试剂盒B、C均可适用于猪繁殖与呼吸综合征临床样品的核酸提取。实际操作中，应根据实验室条件、样品数量、样品类型和时间要求等因素，选择应用合适的提取试剂盒。　　　　自1995年我国暴发猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）疫情以来，该病始终伴随我国养猪业的发展。尤其是2006年暴发的高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）疫情，给我国养猪业造成了巨大的经济损失，此后PRRS成为影响我国养猪业发展的主要疫病之一。2006—2014年，我国猪群中流行的PRRSV主要为高致病性PRRSV（HP-PRRSV）以及针对该毒株的疫苗株，但2014年以后我国许多省份发现的类NADC30 PRRSV又导致了PRRS疫情的波动发生。　　　　对于PRRSV等主要动物疫病病毒的分子生物学检测，除了检测试剂盒的特异性、敏感性和重复性等因素对检测结果影响较大外，病毒RNA提取也是关键环节之一，RNA的提取效率和质量直接影响最终检测结果的准确性。随着高分子材料的快速发展，RNA提取技术已由传统的液相系统分离技术转变为固相载体吸附技术，如膜吸附技术、磁珠吸附技术等，其中膜吸附技术（离心柱提取法）已被普遍应用。该方法提取率较高且质量稳定，但至今未实现高通量自动化操作。磁珠吸附技术（纳米磁珠法）提取效率高，且可通过仪器自动化批量提取，操作简单，目前已被众多实验室采用。　　　　以往试剂比对工作中，往往以质粒、病毒分离株、已知浓度临床样品等作为标准品，但在稳定性和均匀性上均有所局限，难以保证比对试验科学准确。本研究使用国家标准物质“猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质”作为提取样本。该标准物质具有稳定、均匀和准确等特征，是定性和定量测量分析的一种标杆，可应用于检测活动的校准、评估和质量控制，从而为评估核酸提取试剂盒的提取效率提供了支撑。　　　　为优选出提取效率高的核酸提取试剂盒，本研究选择5种试剂盒分别提取不同浓度的PRRSV核酸标准物质，使用荧光RT-PCR和数字RT-PCR方法进行检测，通过Ct值和核酸含量评价病毒RNA提取效率。　　　　材料与方法　　　　标准物质　　　　猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质：编号GBW（E）090930，由中国动物疫病预防控制中心研制，量值为（2.06±0.15）×104 copies/μL，于-20 ℃保存备用。　　　　试剂与仪器　　　　核酸提取试剂盒。5种RNA病毒提取试剂盒，其中试剂盒A（进口）、B（国产）、C（国产）为磁珠法机提，试剂盒D（进口）、E（国产）为柱式手提，分别购自各品牌供应商。　　　　主要试剂。PRRSV通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；One-step RT-ddPCR Kit for Probes，购自伯乐公司。　　　　比较方法　　　　RNA提取。对试剂盒D和E，采用离心柱吸附技术，按照试剂盒说明书，手动提取病毒RNA；对其余3种试剂盒，均采用磁珠法，按照试剂盒说明书，运用相应核酸提取仪，自动提取病毒RNA。分别使用上述5种试剂盒对2种浓度的PRRSV核酸标准物质做3次平行提取，共获得30份提取产物。　　　　荧光定量RT-PCR方法。采用PRRSV荧光RT-PCR检测方法，按照试剂盒说明书对30份提取产物分别进行反转录扩增。通过Ct值比较不同试剂盒的RNA提取效率。　　　　数字RT-PCR方法。采用微滴式PRRSV通用型数字RT-PCR检测方法，对30份提取产物分别进行反转录扩增。通过核酸含量（copies/μL）比较不同试剂盒的RNA提取效率。　　　　不同基质对核酸提取效率的影响。选用TE、抗凝血、血清、血浆、扁桃体、淋巴结、肺脏、精液、唾液、饲料等多种常见基质，探究不同基质对核酸提取效率的影响，其中对组织采取匀浆处理，TE、血清等直接使用。在上述基质中，5倍稀释PRRSV标准物质后，分别提取3次，通过荧光RT-PCR和数字RT-PCR方法进行扩增，比较试剂盒对不同基质中病毒RNA的提取效率。　　　　结果与分析　　　　荧光RT-PCR方法比较提取效果　　　　3种磁珠法机提试剂盒的Ct平均值明显低于柱式手提试剂盒，提取较高浓度核酸标准物质时（2×104 copies/μL），扩增后Ct值从低到高排序为B＜A＜C＜D＜E，其中试剂盒A、C提取的样本扩增后Ct值相近；提取较低浓度核酸标准物质时（4×103 copies/μL），Ct值从低到高排序为C＜B＜A＜D＜E，其中试剂盒B和C提取的样本扩增后Ct值相近。详见表1。